《疑案忠魂》围绕一桩强奸杀人案展开。老刑警马红旗（胡军 饰）和搭档何非（张立 饰）负责此案，他们抓到嫌犯吴德林（王志飞 饰），吴德林很快认罪伏法。然而，案件复查时，新来的年轻检察官周铁（刘威 饰）发现诸多疑点。周铁坚信证据链存在问题，可能造成冤假错案，于是顶住各方压力重新调查。马红旗起初不理解周铁的做法，认为他是在给自己和搭档的工作挑刺，两人产生了激烈冲突。随着调查深入，真相逐渐浮出水面，原来案件背后另有隐情。最终，真凶落网，吴德林沉冤得雪，马红旗也理解了周铁坚持正义的苦心，展现了司法人员对真相和正义的执着追求。